Desde su invención hace ya algunos siglos, los microscopios de luz han mejorado nuestro conocimiento sobre biología básica, investigación biomédica, diagnósticos médicos y otras materias científicas. Los microscopios de luz pueden aumentar objetos hasta mil veces, mostrándonos detalles microscópicos que de otra manera sería imposible poder visualizar. Esta tecnología ha evolucionado muchos desde los primeros microscopios que salieron.
Técnicas especiales y ópticas han sido desarrolladas para revelar la estructura y la bioquímica de células vivientes. Los microscopios incluso han entrado la era digital usando cámaras digitales y otros elementos para poder capturar imágenes. Aun así, los principios básicos de estos avanzados microscopios son muy parecidos a esos microscopios de estudiante que puede que hayas usado si has estudiado biología.
Un microscopio de luz funciona de manera similar a un telescopio de refracción, pero con algunas diferencias. Para entenderlo, veamos de una manera breve como funciona un telescopio. Un telescopio tienen que coleccionar grandes cantidades de luz de un objeto distante y poco visible. Por tanto, necesita lentes grandes para poder “coger” cuanta más luz posible y traerla a un brillante foco.
Al ser el objetivo con lentes bastante grande, trae la imagen del objetivo a un foco que cierta distancia, que es el motivo de porque los telescopios son mucho más largos que los microscopios. La parte del telescopio entonces magnifica la imagen según la trae a nuestros ojos.
En contraste a un telescopio, un microscopio tienen que agrupar la luz de una diminuta área de un espécimen bien iluminado que está cerca. Por lo tanto, un microscopio n o necesita un objetivo grande con lentes. En lugar de ello, su lente es pequeña y esférica, lo cual significa que tiene una longitud de foco más corta en el otro lado. Trae la imagen del objetivo al foco en una distancia corta dentro del tubo del microscopio. La imagen es entonces agrandada por una segunda lente llamada lente ocular.
La otra gran diferencia entre un telescopio y un microscopio es que este último tiene una fuente de luz y un condensador. El condensador es un sistema de lentes que enfoca la luz de la fuente en un diminuto y brillante punto, que es la misma área que la lente del objetivo examina. También y a diferencia de un telescopio, el cual tiene lentes objetivo fijas y lentes oculares intercambiables, los microscopios tienen lentes objetivo intercambiables y lentes oculares fijas. Al cambiar las lentes de objetivo (yendo de unos objetivos relativamente planos de poca magnificación, a objetivos de alta magnificación), un microscopio puede mostrar áreas muy pequeñas – la recolección de luz no es la tarea principal del objetivo de lentes de un microscopio, como ocurre con un telescopio.
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Calidad de imagen de microscopio
Cuando observas a un espécimen usando un microscopio, la calidad de la imagen es conseguida por varias funciones. Una de ellas es el brillo. ¿Cómo de brillante u oscura es la imagen? El brillo está relacionado con el sistema de iluminación, y puede ser cambiado al modificar el voltaje de la lámpara y ajustando el condensador y las aperturas del diafragma. El brillo también está relacionado con la apertura numérica en la lente del objetivo (cuanta más grande sea la apertura, más brillantes será la imagen).
El foco es otra parte importante. ¿Está la imagen borrosa o bien definida? Es foco está relacionado con la longitud de foco, y puede ser controlado con los mandos que vienen para tal fin. El espesor de la cubierta de cristal en la placa donde está el espécimen a observar, puede también afectar la capacidad de enfocar la imagen – puede ser demasiado grueso para el objetivo de la lente. El correcto espesor de la cubierta de cristal está escrito en un lado del objetivo de la lente.
Otro campo importante es la resolución., ¿Cómo de cerca pueden estar dos puntos en la imagen antes de que ya no se puedan ver como dos puntos separados? La resolución está relacionada a la apertura numérica del objetivo de la lente (cuanto más grande sea la apertura, mejor será la resolución) y la longitud de onda la luz pasando a través de la lente (cuanto más corta sea la longitud de onda, mejor será).
Por último tenemos el contraste. ¿Cuál es la diferencia en la iluminación entre las áreas adyacentes del espécimen a observar? El contraste está relacionado con el sistema de iluminación y puede ser ajustado al cambiar la intensidad de la luz y la apertura del diafragma. Por otro lado, La aplicación de ciertos productos químicos aplicados al espécimen, pueden mejorar el contraste. Más o menos, estos son los factores que nos dan una buena imagen de microscopio.
¿Qué tipos de microscopio hay?
Un problema grande en observar especímenes con un microscopio es que sus imágenes no tienen mucho contraste. Esto es especialmente verdad en las cosas que están vivas (como por ejemplo las células), aunque los pigmentos naturales, como por ejemplo el verde de las hojas, puede dar un buen contraste.
Una manera de mejorar el contraste es tratar el espécimen con pigmentos coloreados o sustancias para teñir que se unen a estructuras específicas dentro del espécimen. Los diferentes tipos de microscopio han sido desarrollados para mejorar el contraste de los especímenes. Las especializaciones están principalmente en los sistemas de iluminación y los tipos de luz que pasan a través del espécimen.
Por ejemplo, un microscopio de campo oscuro usa un condensador especial para bloquear la mayoría del brillo de la luz e iluminar el espécimen con una luz oblicua, de forma parecida a como la luna bloquea la luz solar en un eclipse. Esta configuración óptica provee un fondo totalmente negro y mejora el contraste de la imagen para mostrar detalles más definidos – áreas brillantes en los bordes dentro del espécimen.
Como se ha dicho, hay varias técnicas para usar en microscopios, siendo una por ejemplo la que se acaba de explicar (microscopio de campo oscuro). El microscopio de campo brillante es la configuración más básica de un microscopio. Esta técnica tiene poco contraste: las imágenes que se ven se consiguen “tiñendo” al espécimen. Por otro lado, la iluminación Rheinberg es parecida a la del campo oscuro, pero usa una serie de filtros para producir el “teñido óptico” del espécimen.
Las técnicas siguientes usan los principios básicos de la iluminación Rheinberg, consiguiendo diferentes resultados usando componentes ópticos diferentes. La idea básica conlleva dividiendo el rayo de luz en dos caminos que iluminan el espécimen. Las ondas de luz que pasan por estructuras densas dentro del espécimen se ralentizan comparadas a aquellas que pasan por estructuras menos densas. Como toda la luz es coleccionada y transmitida a la pieza ocular, son recombinadas para que puedan interactuar entre ellas. Los patrones de interferencia proveen contraste: Pueden mostrar áreas oscuras (más densas) en un fondo iluminado (menos denso), o crear un tipo de falsa imagen en tres dimensiones.
Contraste de fase – Este técnica es la mejor para observar especímenes vivos, como por ejemplo células. En uno de estos microscopios, los anillos anulares en las lentes y el condensador separan la luz. La luz que pasa por la parte central del camino de la luz es recombinada co la luz que viaja alrededor de la periferia del espécimen. La interferencia producida por estos dos caminos produce imágenes donde las estructuras densas aparecen más oscuras que el fondo.
Contraste de interferencia diferencial – Usa filtros de polarización y prismas para separar y recombinar las rutas de luz, dando una apariencia de tres dimensiones al espécimen.
Contraste de modulación Hoffman – Este tipo de contraste es similar al anterior, excepto que usa una pletina con aberturas más pequeñas en ambos ejes de las rutas de luz para producir dos configuraciones de luz que pasan por el espécimen. De nuevo, se crea una imagen en tres dimensiones.
Polarización – Un microscopio de polarización de luz usa dos polarizadores, uno en cada lado del espécimen, posicionados perpendicularmente entre ellos por lo que la única luz que pasa por el espécimen llegada a la pieza ocular. La luz es polarizada en un plano según pasa por el primer filtro y llega al espécimen. Se forma espaciada, las partes obtenidas del espécimen rotan la luz según pasan por ellos. Algunas de estas luces rotadas pasan por el segundo filtro de polarización, por lo que estas áreas espaciadas se muestran brillantes en un fondo negro.
Fluorescencia – Este tipo de microscopio usa una longitud de onda corta de alta energía (normalmente ultravioleta) para excitar electrones dentro de ciertas moléculas dentro de un espécimen, causando que estos electrones se muevan a órbitas más altas. Cuando caen a sus niveles de energía originales, emiten ondas de luz más largas de energía baja (normalmente en el espectro visible), lo cual forma la imagen.
¿Cómo funciona un microscopio de fluorescencia?
Un microscopio de fluorescencia usa una lámpara de mercurio o neon para producir luz ultravioleta. La luz llegar al microscopio e incide contra un espejo dicroico – un espejo que refleja un rango de longitud de ondas y permite que otro rango pase a través. El espejo dicroico refleja la luz ultravioleta directamente al espécimen que se quiere observar. Esta luz ultravioleta excita la fluorescencia dentro de las moléculas en el espécimen. Las lentes colectan la luz de longitud de onda fluorescente producida. Esta luz pasa por el espejo dicroico y la barrera de filtrado (esto elimina las longitudes de onda que no sean las fluorescentes, haciendo que se forme la imagen.
Las moléculas fluorescentes dentro del espécimen pueden ocurrir tanto de una forma natural o de forma inducida. Por ejemplo, se pueden teñir las células con un producto llamado calceína-AM. Por si mismo, el producto no es fluorescente. La porción AM de la molécula esconde una porción de la molécula de calceína que tapa al calcio, que es fluorescente.
Cuando mezclas la calceína-AM con la solución que baña a las células, el elemento que tiñe se introduce en la célula. Las células vivientes tienen un enzima que quita la porción de AM, atrapa la calceína dentro de la célula y permite que se enlace con el calcio por lo que despide luz verde fluorescente bajo la luz ultravioleta.
Las células muertas no tienen esta enzima. Por tanto, las células vivientes brillarán con una luz verde fluorescente, mientras que las células muertas no lo harán. Se pueden ver las células muertas en el mismo espécimen si mezclas otros elementos para hacer este “teñido”. Hay técnicos, como la del doble teñido, que se usa en estudios de toxicología para determinar el porcentaje de células que mueren cuando son tratadas con algún agente químico, como por ejemplo un pesticida.
Las técnicas usadas en los microscopios de fluorescencia son útiles para ver estructuras y medir eventos en células vivas en muchos aspectos. Varios indicadores fluorescentes están disponibles para estudiar varias materias químicas importantes, como puede ser el ADN, enzimas varias, calcio, magnesio, etc. Aparte de esto, los anticuerpos que son específicos a varias moléculas biológicas, pueden ser enlazados químicamente a moléculas fluorescentes y usadas para teñir estructuras específicas dentro de las células.
Las partes del microscopio de luz
Un microscopio de luz, ya sea de un estudiante o un complejo de investigación, tienen unos sistemas muy básicos. Para empezar tiene un control de espécimen, para poder sujetar y manipular la base donde se tiene que poner el espécimen a estudiar, y que lo mantiene quieto (al estar observando una imagen magnificada, incluso el movimiento más pequeño del espécimen puede mover partes de la imagen fuera del campo de visión). Esto se consigue con un dispositivo preparado que permite mover al espécimen de manera controlada y en incrementos, lo cual es muy útil para escanear la placa.
La iluminación es otro punto importante para poder dar una luz adecuada al espécimen (el sistema más simple de iluminación es un espejo que refleja la luz de la habitación en la que estamos en la placa de lo que estamos observando). Una lámpara produce la luz y normalmente son bombillas normales, aunque para aplicaciones especializadas, se pueden usar lámparas de neon o mercurio con luz ultravioleta. Algunos microscopios incluso usan lásers para poder escanear el espécimen. Un reóstato altera la corriente aplicada a la lámpara para controlar la intensidad del condensador productor de luz – un sistema de lentes que alinea y enfoca la luz de la lámpara en el diafragma o elementos de apertura para ver el espécimen – puestos en el camino de la luz para alterar la cantidad de luz que llega al condensador.
Otra parte vital son las lentes, para poder formar la imagen. Lo que hace básicamente es capturar luz. Transmite y magnifica la imagen del objetivo, mantiene la pieza ocular a la distancia apropiada de la lente del objetivo y bloquea restos de luz no deseados. Otra parte es el foco – posiciona la lente del objetivo a la distancia apropiada del espécimen. Se usan para hacer los ajustes finos y tener más claridad de imagen.
Hay también un brazo de soporte y alineamiento, que es una porción curvada que sostiene todas las partes ópticas a una distancia fija, y las alinea con la base. Soporta el peso de todas las partes del microscopio, donde el tubo está conectado al brazo del microscopio por medio de un rack y un engranaje de piñones.
Este sistema nos permite enfocar la imagen cuando estamos cambiando las lentes y alejarlas del punto de observación cuando se cambian los especimenes. Algunas de las partes mencionadas varían entre microscopios. Realmente los microscopios vienen en dos configuraciones básicas: verticales e invertidas.
El sistema vertical tiene el sistema de iluminación por debajo de la placa y el sistema de lentes por encima. Un microscopio invertido es al revés, y tiene el sistema de iluminación sobre la placa del espécimen y las lentes por debajo. Este último tipo es mejor para poder ver a través de especímenes más gruesos, ya que las lentes se pueden acercar más al fondo del plato, donde las células crecen.
Los microscopios de luz pueden revelar las estructuras de tejidos y células vivas, como también de muestras no vivas, como pueden ser rocas o semiconductores. Los microscopios puedes simples o complejos en diseño, y algunos pueden hacer varias funciones, cada una revelando información ligeramente diferente. El microscopio de luz ha hecho avanzar enormemente nuestro conocimiento biomédico y continúa siendo una potente herramienta para los científicos.
